Цель исследования: изучить содержание уровней фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor, VEGF) VEGF-A, рецептора VEGFR1, VEGF-C, рецептора VEGFR3, трансформирующего фактора роста β (Transforming growth factor β, TGF-β), инсулиноподобного фактора роста (Insulin-like growth factor, IGF) IGF-1, IGF-2 и инсулиноподобного фактора роста — связывающего белка 3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3, IGFBP3) в ткани метастатически пораженного и не пораженного большого сальника у больных раком яичников (РЯ) с целью выявления преметастатических ниш заболевания.
Материал и методы: в исследование вошли образцы тканей большого сальника 51 пациентки с РЯ Т2–3NxM0–1, группу контроля составили 17 больных, сопоставимых по возрасту, с неонкологическими заболеваниями. Уровни VEGF-A, VEGFR1, VEGF-C, VEGFR3, IGF-1, IGF-2, IGFBP3 и TGF-β1 определяли с помощью стандартных тест-систем иммуноферментного анализа.
Результаты исследования: экспрессия VEGF-A была выше не только в метастатически пораженном большом сальнике, но и в сальнике без морфологических признаков метастазирования, инициируя в нем процесс ангиогенеза. Высокая экспрессия VEGF-C и VEGFR3 инициирует процесс лимфангиогенеза в уже пораженном сальнике. Более выраженная экспрессия VEGF-A, VEGF-С и их рецепторов в метастазах подтверждает концепцию использования антиангиогенного лечения при диссеминированной карциноме и для лечения пациентов с резидуальными опухолями. Уровни IGF-2 и IGFBP3 не имели достоверного отличия между пораженными и непораженными участками большого сальника в организме больных РЯ, однако значимо превышали этот показатель в группе контроля. Нами получено более высокое содержание TGF-β1 в ткани большого сальника, еще не пораженного опухолевым процессом, по сравнению с метастатически измененными тканями сальника.
Заключение: взаимодействие между VEGF-A, IGF-1 и TGF-β может служить регулятором метаболического состояния органов для вторичных опухолей, маркируя преметастатическую нишу и обеспечивая мезенхимально-эпителиальный переход циркулирующих опухолевых клеток.
Ключевые слова: рак яичников, преметастатическая ниша, метастатически пораженный большой сальник, большой сальник без метастазов, фактор роста эндотелия сосудов, VEGF-A, VEGF-C, IGF-1, TGF-β.
E.M. Frantsiyants, T.I. Moiseenko, D.Yu. Yakubova, N.D. Cheryarina, A.P. Men’shenina, E.V. Verenikina, M.L. Adamyan
National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
Aim: to evaluate the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) A and C, VEGF receptor (VEGFR) 1 and 3, transforming growth factor β (TGF-β), insulin-like growth factor (IGF) 1 and 2, and insulin-like growth factor-binding protein 3 (IGFBP3) in women with and without omental metastasis of ovarian cancer to identify pre-metastatic niches.
Patients and Methods: omental samples obtained from 51 women with ovarian cancer (stage Т2–3NxM0–1) were examined. Controls were 17 age-matched women with non-oncological diseases. The levels of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR1, VEGFR3, IGF-1, IGF-2, IGFBP3, and TGF-β1 were measured by standard ELISA protocols.
Results: VEGF-A expression was higher both in omental metastasis and omentum without morphological signs of metastasis thus initiating angiogenesis. High expression of VEGF-C and VEGFR3 initiates lymphangiogenesis in omental metastasis. Greater expression of VEGF-A, VEGF-С, and their receptors in metastases favors antiangiogenic treatment approach in disseminated carcinoma and residual cancer. The levels of IGF-2 and IGFBP3 were similar in omental metastasis and intact omentum in ovarian cancer but were significantly higher as compared with the control group. TGF-β1 level was higher in intact omentum as compared with omental metastasis.
Conclusion: the interaction between VEGF-A, IGF-1, and TGF-β may be a regulator of organ metabolic conditions by labelling pre-metastatic niches and providing mesenchymal-epithelial transition of circulating tumor cells.
Keywords: ovarian cancer, pre-metastatic niche, omental metastasis, greater omentum without metastases, vascular endothelial growth factor, VEGF-A, VEGF-C, IGF-1, TGF-β.
For citation: Frantsiyants E.M., Moiseenko T.I., Yakubova D.Yu. et al. VEGF family members, IGF, and TGF-β1 in the omentum in ovarian cancer. Russian Medical Inquiry. 2020;4(3):132–136. DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-3-132-136.
Рак яичников (РЯ) — фатальное гинекологическое злокачественное новообразование, характеризующееся диссеминированным перитонеальным метастазированием [1]. РЯ обладает специфическим метастатическим тропизмом к большому сальнику с высоким содержанием жиров. Имеются данные, свидетельствующие о том, что большой сальник играет ключевую роль в создании микроокружения метастатической опухоли в брюшной полости [2].
Распространение серозного РЯ представляет собой уникальный молекулярный механизм. Понимание молекулярных и клеточных детерминант образования метастатических клеток рака, высвобождения и взаимодействия их с микросредой поможет сформировать фундаментальную основу патогенеза РЯ, которая необходима для создания новых методов лечения, направленных на предотвращение перитонеальной диссеминации [3].
Исследования с использованием эксплантатов сальниковой ткани больных РЯ, адаптированных к условиям трехмерной культуры ex vivo, подтвердили наличие тесной взаимосвязи между популяциями клеток большого сальника и опухолями. А.К. Mitra et al. (2012) [4] предоставили доказательства того, что секреторные и провоспалительные свойства опухолей яичников изменяют сальниковые фибробласты в фибробласты, ассоциированные с раком, которые секретируют ростовые и хемотаксические молекулы для поддержки прогрессирования опухоли.
Сигнальные пути семейства VEGF (Vascular endothelial growth factor, фактора роста эндотелия сосудов) играют основную роль в ангиогенезе и лимфангиогенезе опухоли [5, 6]. VEGF-A, -B, -C и -D и PIGF (Placental growth factor, плацентарный фактор роста) передают сигналы через три рецептора тирозинкиназы: VEGFR1, 2 и 3. VEGF-A связывается с VEGFR1 и VEGFR2 и является основным стимулятором роста и распространения опухоли. Передача сигналов VEGF-A/VEGFR2 считается наиболее важным путем ангиогенеза опухоли, индуцируя эндотелиальную проницаемость и стимулируя накопление асцитической жидкости у больных РЯ [7, 8]. VEGF-C и -D действуют в основном через VEGFR3, стимулируя лимфангиогенез и способствуя образованию ангиогенных ростков [9].
Сигнальный путь IGF (Insulin-like growth factor, инсулиноподобный фактор роста) модулирует энергетический обмен и рост клеток в нормальных условиях. В последние годы было показано, что IGF и его активация передачи сигналов вовлечены в пролиферацию раковых клеток, антиапоптоз и метастазирование при различных видах рака, а сигнальный путь IGF-1 индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход посредством активации сигнального преобразователя и активатора транскрипции 5 (Signal transducer and activator of transcription 5 — Stat5) [10].
TGF-β (Transforming growth factor β, трансформирующий фактор роста β) может вызывать эпителиально-мезенхимальный переход и миграцию опухолевых клеток, увеличивать их агрессивность и выживаемость, изменять характеристики клеток, реконструировать внеклеточную матрицу и повышать метаболизм клеток, благоприятный для инвазии РЯ и метастазирования [11].
Целью настоящего исследования явилось изучение содержания VEGF-A, VEGFR1, VEGF-C, VEGFR3, TGF-β, IGF-1, IGF-2 и IGFBP3 в ткани метастатически пораженного и не пораженного большого сальника у больных РЯ.
В исследование вошли образцы тканей большого сальника 51 больной РЯ Т2–3NxM0–1 (группа 2), из них метастазы в сальник имели 37 пациенток, без метастазов — 14 пациенток. Средний возраст больных составил 60±1,9 года. Диагноз у всех больных был верифицирован на догоспитальном этапе, обследование проведено согласно рекомендуемым стандартам. Группу контроля составили 17 больных аналогичного возраста с неонкологическими заболеваниями.
Операция всем больным была выполнена в стандартно рекомендуемом объеме: пангистерэктомия, оментэктомия, оптимальное/субоптимальное удаление видимых метастатических очагов в пределах брюшной полости. Все удаленные органы и ткани подвергались морфологическому исследованию. Гистологически все удаленные опухоли являлись серозной цистаденокарциномой G2–G3. Для иммуноферментного анализа (ИФА) проводился интраоперационный забор образцов пораженных и непораженных фрагментов большого сальника.
Ткани гомогенизировали, получали 10% цитозольную фракцию, приготовленную на 0,1 молярном калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% бычий сывороточный альбумин. После центрифугирования образцы хранили при -80° C для анализов с помощью ИФА. Замороженные образцы медленно оттаивали при 4° С. За полчаса до экспериментов образцы оставались при комнатной температуре. Уровни VEGF-A, VEGFR1, VEGF-C, VEGFR3, IGF-1, IGF-2, IGFBP3 и TGF-β1 определяли с помощью стандартных тест-систем ИФА (Bendermedsystem, Австрия).
Все процедуры были одобрены комитетом по этике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России.
Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 10,0 c определением средних значений и указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Существенными считали различия при p<0,05. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.
Результаты исследования представлены в таблице 1. Установлено, что в ткани сальника больных РЯ без метастатического процесса уровень VEGF-A был выше показателя в ткани контрольной группы в 2,6 раза, а VEGFR1 не имел достоверных отличий от показателей контрольной группы. В ткани сальника, пораженного метастазами, содержание VEGF-A и VEGFR1 было повышенным в 6,3 раза и 3,1 раза относительно таковых в группе контроля и в 2,5 раза и 2,8 раза — относительно ткани сальника без метастазов.
Содержание VEGF-C в ткани сальника больных РЯ без метастатического процесса было снижено относительно показателей в контрольной группе в 5,5 раза, а VEGFR3, напротив, повышено в 2,2 раза. В ткани сальника, пораженного метастазами, содержание VEGF-C и VEGFR3 было выше в 7,8 раза и 3,6 раза относительно величин в контрольной группе и в 43,3 раза и 1,6 раза (р<0,05) выше, чем в ткани сальника, не пораженного злокачественным процессом.
Уровень IGF-2 и IGFBP3 в ткани сальника, не пораженного метастазами, не имел достоверных отличий от показателей в контрольной группе. Вместе с тем содержание IGF-1 в указанных образцах превосходило значения контрольной группы в 2 раза. В ткани сальника, пораженного метастазами, уровень IGF-1, IGF-2 и IGFBP3 был выше значений контрольной группы в 4,9 раза, 2,8 раза и 3,4 раза соответственно и выше показателей в ткани сальника, не пораженного метастазами, в 2,5 раза, 2,2 раза и 3,6 раза соответственно.
Содержание TGF-β1 было повышено в ткани сальника, не пораженного метастатическим процессом, в 2,9 раза, а в ткани метастатического сальника — в 2,3 раза.
Таким образом, найдены изменения уровня некоторых факторов роста, связанные с метастатическим поражением сальника при РЯ.
70% вновь диагностированных больных РЯ и почти все рецидивирующие случаи имеют скопление многоклеточных опухолевых клеток в брюшной полости, взвешенных в перитонеальной жидкости [12]. Некоторые из отдельных опухолевых клеточных кластеров, взвешенных в асцитической жидкости, поддерживают жизнеспособность и колонизируют висцеральную и париетальную брюшины малого таза и брюшной полости посредством движения перитонеального выпота [13]. Исследование неклеточных фракций асцитической жидкости, выделенных у пациенток с РЯ, выявило наличие митогенных факторов, компонентов внеклеточного матрикса и различных провоспалительных молекул [14].
Чтобы обеспечить адекватное кровоснабжение, гемопоэтические клетки-предшественники инициируют процесс ангиогенеза в преметастатической нише [15]. Локальные эндотелиальные клетки-предшественники способствуют ангиогенезу посредством передачи сигналов VEGF [16]. Этот предшествующий ангиогенез делает преметастатическую нишу способной удовлетворить потребность опухоли в питательных веществах для последующего быстрого метастатического роста.
Наши результаты показывают, что VEGF-A, по-видимому, является перспективным ангиогенным маркером при метастатическом РЯ. Экспрессия VEGF-A была выше не только в метастатически пораженном большом сальнике, но и в сальнике без морфологических признаков метастазирования, инициируя в нем процесс ангиогенеза. Что касается лимфангиогенных факторов, высокая экспрессия VEGF-C и VEGFR3 инициирует процесс лимфангиогенеза в уже пораженном сальнике. Однако в преметастатической нише, какой можно считать большой сальник, еще не пораженный метастазами, но находящийся в организме больной РЯ, лимфангиогенез, вероятно, подавлен для снижения дренирующей функции. Наши нынешние результаты показали более сильную экспрессию VEGF-A, VEGF-С и их рецепторов в метастазах, подтверждая концепцию использования антиангиогенного лечения при диссеминированной карциноме и для лечения пациентов с резидуальными опухолями. Для повышения эффективности противоопухолевого лечения было бы полезно блокировать как ангиогенный, так и лимфангиогенный путь при РЯ.
Семейство IGF представляет собой сложный молекулярный сигнальный путь, который играет важную роль в онкогенезе, прогрессировании опухоли и метастазировании [17]. Одним из ключевых факторов в этом семействе является IGF-1, который является эндокринным и аутокринным/паракринным пептидом, экспрессирующимся в большинстве типов клеток. При развитии опухолевого процесса IGF-1 и IGFBP-3 участвуют в клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе. Некоторые эпидемиологические исследования предполагают связь циркулирующих уровней IGF-1 / IGFBP-3 с риском развития РЯ [18].
Наши результаты показывают, что IGF-1 может служить регулятором метаболизма по аутокринно-паракринному пути в ткани еще не пораженного метастазами сальника, т. к. все члены этого семейства участвуют в метастазировании. Сообщалось, что секреция IGFBP-3 стимулируется VEGF, а секреция IGF, IGFBP-3 и VEGF вызывается индуцируемым гипоксией фактором (Hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α) [19].
TGF-β является плейотропным цитокином, который контролирует пролиферацию, дифференцировку, эмбриональное развитие, ангиогенез, заживление ран и другие функции во многих типах клеток. При распространенных формах рака TGF-β индуцирует множество метаболических путей, которые приводят к росту, инвазии и метастазированию раковых клеток [20].
Мы показали, что TGF-β экспрессируется не только в ткани метастатически пораженного сальника, что согласуется с вышеприведенными данными, но и в ткани сальника, еще не пораженного злокачественным процессом, но находящегося в организме больных РЯ. Этот факт можно рассматривать двояко. С одной стороны, известно, что TGF-β действует как супрессор опухолей в нормальных эпителиальных клетках и на ранних стадиях опухолевого процесса [20], с другой — TGF-β индуцирует прогрессирование рака через эпителиально-мезенхимальный переход, который является важным этапом инвазии и метастазирования рака [11]. И нам ближе вторая точка зрения.
Таким образом, результаты данного исследования свидетельствуют о том, что взаимодействие между VEGF-A, IGF-1 и TGF-β может служить регулятором метаболического состояния органов для вторичных опухолей, маркируя преметастатическую нишу и обеспечивая мезенхимально-эпителиальный переход циркулирующих опухолевых клеток. Несомненно, понимание тонких механизмов взаимодействия данных факторов в предопухолевых нишах приблизит фармакологов и онкологов к повышению эффективности лечения больных РЯ — заболевания с чрезвычайно высокой тропностью к имплантационному метастазированию.
Сведения об авторах:
Франциянц Елена Михайловна — д.б.н., профессор, заместитель генерального директора по науке, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0003-3618-6890.
Моисеенко Татьяна Ивановна — д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела опухолей репродуктивной системы, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0003-4037-7649.
Якубова Дарья Юрьевна — аспирант отделения онкогинекологии, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0001-8204-0855.
Черярина Наталья Дмитриевна — научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза опухолей, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0002-3711-8155.
Меньшенина Анна Петровна — к.м.н., ведущий научный сотрудник отдела опухолей репродуктивной системы, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0002-7968-5078.
Вереникина Екатерина Владимировна — к.м.н., заведующая отделением онкогинекологии, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0002-1084-5176.
Адамян Мери Людвиковна — к.м.н., научный сотрудник отдела опухолей репродуктивной системы, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, 344037, Россия, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, д. 63; ORCID iD 0000-0003-4188-3746.
Контактная информация: Меньшенина Анна Петровна, e-mail: anna.menshenina.00@mail.ru. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 15.05.2020, поступила после рецензирования 29.05.2020, принята в печать 11.06.2020.
About the authors:
Elena M. Frantsiyants — Dr. of Sci. (Biol.), Deputy Director General for Science, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3618-6890.
Tat’yana I. Moiseenko — Dr. of Sci. (Med.) Professor, Senior Researcher of the Division of Reproductive System Tumors, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4037-7649.
Dar’ya Yu. Yakubova — postgraduate student of the Department of Oncogynecology, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-8204-0855.
Natal’ya D. Cheryarina — Researcher of the Laboratory of the Study of Tumor Pathogenesis, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-3711-8155.
Anna P. Men’shenina — Cand. of Sci. (Med.), Leading Researcher of the Division of Reproductive System Tumors, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-7968-5078.
Ekaterina V. Verenikina — Cand. of Sci. (Med.), Head of the Department of Oncogynecology, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-1084-5176.
Meri L. Adamyan — Cand. of Sci. (Med.), Researcher of the Division of Reproductive System Tumors, National Medical Research Centre for Oncology. 63, 14th Line, Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4188-3746.
Contact information: Anna P. Men’shenina, e-mail: anna.menshenina.00@mail.ru. Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 15.05.2020, revised 29.05.2020, accepted 11.06.2020.