Метагеном и заболевания желудка: взаимосвязь и взаимовлияние

Статья посвящена вопросам взаимосвязи метагенома и заболеваний желудка.

    Микробиота желудка

    Желудок долгое время считался почти стерильным органом благодаря продукции соляной кислоты. Однако открытие Helicobacter pylori (HP) показало, что существуют микроорганизмы, не только приспособленные к выживанию в кислой среде, но и колонизирующие именно этот отдел пищеварительного тракта.
    Появление современных молекулярно-генетических методов исследования, основанных на амплификации бактериальных генов 16S рибосомальной РНК (рРНК), позволило получить более полную информацию о представителях микробного сообщества желудка. Оказалось, что микробиота желудка значительно более разнообразна, чем представлялось ранее: в нескольких современных исследованиях идентифицировано более 200 бактериальных филотипов. Несмотря на агрессивные условия среды, в желудке обнаружены представители тех же типов, которые доминируют и в других отделах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Е.М. Bik et al. [1] впервые исследовали 16S-рДНК последовательности в биоптатах слизистой оболочки желудка 23 взрослых пациентов, направленных на эндоскопию. Они установили, что среди представителей желудочного бактериального сообщества доминируют 5 основных типов микробов: Proteobacteria; Firmicutes; Bacteroidetes; Actinobacteria и Fusobacteria. Остальные желудочные 16S-рДНК последовательности могут быть отнесены к Deferribacteres и Deinococcus. Из 128 филотипов, выявленных в этом исследовании, 64 (50%) относились к ранее не культивируемым бактериям. Из них 43 (67%) были ранее обнаружены в ротовой полости людей, что подтверждает вероятность формирования микробиома желудка не как абсолютно изолированного сообщества, а как физиологически связанного с соседними органами и пополняемого при попадании содержимого, в основном из вышележащих отделов. Среди не культивировавшихся ранее микробов в желудке были выявлены Caulobacter, Actinobacillus, Corynebacterium, Rothia, Gemella, Leptotrichia, Porphyromonas, Capnocytophaga, TM7, Flexistipes, Deinococcus [2].
    HP в данном исследовании был единственным из рода Helicobacter и представлял собой наиболее многочисленный вид. Он был обнаружен у 19 из 23 пациентов и составлял 42% всей совокупности 16S-рДНК последовательностей. Следующими по частоте после Helicobacter родами бактерий в желудочном микробиоме были Streptococcus (299 клонов) и Prevotella (139 клонов) [2].
    Максимальное богатство видов бактерий в желудочном микробиоме было обнаружено у пациентов (138,8±66,3), у которых не был выявлен H. pylori (HP(-)), у них же был выше индекс разнообразия микробов (индекс Shannon) — 3,1. У больных, имевших H. pylori (HP(+)), отмечено уменьшение видового богатства (81,2±15,1) и индекса Shannon (1,6). HP(+) больные демонстрировали значительное уменьшение численности всех микробных типов, кроме Proteobacteria, особенно снижена была численность Bacteroidetes. Сравнение состава микробиоты антрального отдела и тела желудка у обследованных пациентов не выявило достоверных отличий [2].
    Исследования на животных показали, что колонизация желудка HP, особенно длительная, влияет на состав желудочного микробиома в целом. У HP(-) особей, в отличие от HP(+), в желудке обитает большое количество Eubacterium cylindroides и различных видов Prevotella, но отмечено относительно небольшое количество Bifidobacterium, Clostridium leptum и Clostridium coccoides [3]. У не инфицированных HP людей количество Proteobacteria было небольшим, но присутствовало значительно больше видов Prevotella и Streptococcus, чем у инфицированных [4]. У HP(+) пациентов было отмечено доминирующее представительство классов Proteobacteria, Spirochetes, Actinobacteria.
    Подобные микробиологические изменения могут объясняться несколькими причинами. Длительная HP-инфекция приводит к развитию атрофии слизистой оболочки желудка, что сопровождается снижением секреторной функции и повышением рН. Это способствует колонизации желудка различными микробами. В дополнение аммиак и бикарбонаты, образующиеся в результате гидролиза мочевины уреазой HP, могут быть использованы как субстраты другими микроорганизмами. Наконец, колонизация HP может нарушать моторику желудка, влияя таким образом на клиренс адгезированных к эпителию желудка бактерий. В процессе прогрессирования хронического гастрита и развития выраженной атрофии снижается секреция, и локальные условия обитания НР настолько меняются, что могут уже не соответствовать его потребностям. Поэтому степень обсемененности НР может снижаться, но создаются благоприятные условия для менее устойчивых к кислоте и неконкурентоспособных видов бактерий. То есть НР создает условия и определенные ниши, которые в процессе прогрессирования атрофии заполняются другими микробами. Однако на ранних этапах развития хронического гастрита окружающая НР микробиота не претерпевает значительных изменений. В недавнем исследовании Khosravi et al. [5] подтвердили это, сравнив большие группы НР(+) (131 человек) и НР(-) (84 человека) пациентов. Вероятно, не само присутствие НР, а инициированные им изменения, такие как поддержание воспаления, наличие атрофии и кишечной метаплазии, их протяженность и локализация, а также длительность инфекции являются определяющими для изменения состава желудочного микробиома в целом [2].
    В процессе прогрессирования хронического гастрита на фоне атрофии и снижения желудочной секреции микробная колонизация желудка усиливается, это коррелирует с увеличением продукции нитритов в желудке [6] благодаря нарастанию числа нитрат-редуцирующих бактерий. Haemophilus и Veillonella редуцируют нитраты быстрее, чем нитриты, поэтому именно они могут быть ответственны за накопление нитритов в желудке. Как известно, эндогенные N-нитрозосоединения в значительной степени ассоциированы с развитием рака желудка [7]. Окисляющие аммоний бактерии, обладающие аммоний-монооксидазой и гидроксиламин-оксидоредуктазой, катализируют образование нитритов из аммония в присутствии кислорода [8]. Эти бактерии в основном относятся к представителям класса Planctomycetes [9]. Логично было бы предположить, что не только НР, но и другая микробиота желудка может играть определенную роль в канцерогенезе. Исследования на животных и людях показали, что колонизация желудка бактериями, естественной средой обитания которых являются нижние отделы ЖКТ, усугубляет последствия НР-инфекции и риск развития рака желудка [2, 10].
    Мыши одной и той же генетической модели C57BL/6N, но выращенные в разных лабораториях в различных условиях, а затем инфицированные одним и тем же штаммом НР, в итоге имели разную степень выраженности воспаления, атрофии и кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка. Исследование нехеликобактерной микробиоты желудка этих двух групп показало существенные ее отличия, особенно в количестве лактобацилл [11], что подтверждает адъювантную роль сопутствующей микробиоты в развитии НР-ассоциированной патологии желудка.
   
В другом исследовании безмикробные трансгенные INS-GAS мыши, предрасположенные к развитию рака желудка вследствие гиперпродукции гастрина, были разделены на 2 группы: одна инфицирована НР, оставаясь в стерильных условиях, другая — в сочетании с колонизацией обычной кишечной микробиотой. Интраэпителиальная неоплазия развивалась значительно быстрее у мышей из второй группы [12]. Искусственная колонизация желудка кишечной микробиотой, включавшей виды Clostridium, Lactobacillus murinus и Bacteroidetes, повысила частоту развития неоплазий желудка у генетически предрасположенных мышей, и через 7 мес. после заражения НР неоплазия развилась практически у всех особей. У стерильных мышей после инфицирования НР опухоли развивались медленнее и значительно реже [2, 13].
    Перекрестное исследование, включавшее 720 здоровых взрослых добровольцев в Китае, подтвердило предположение, что снижение микробного разнообразия может предрасполагать к развитию рака желудка. Этот вывод был сделан на основании оценки взаимосвязи микробного многообразия и соотношения пепсиноген I / пепсиноген II. Чем меньше было представлено видов, тем ниже соотношение пепсиногенов, что коррелирует с вероятностью атрофии слизистой оболочки тела желудка — предрасполагающего к развитию рака желудка состояния [14].
    Недавно был прослежен постепенный сдвиг в профиле микробиоты желудка от неатрофического гастрита к кишечной метаплазии и затем кишечному типу рака желудка [15]. Было обнаружено различие в количестве, составе и разнообразии микробиоты желудка при этих трех состояниях, особенно при наличии НР. У больных раком желудка была значительно снижена представленность класса Epsilonproteobacteria и семейства Helicobacteriaceae, а численность Streptococcaceae, напротив, повышена. Плотность колонизации и разнообразие микробиоты у больных раком желудка возрастали. По мере прогрессирования от неатрофического гастрита через атрофию и кишечную метаплазию к раку отмечены снижение численности видов Porphyromonas, Neisseria, Bulleidia, Prevotella pallens, Streptococcus sinensis и Bergeriella denitrificans, повышение — Lactobacillus coleohominis и Lachnospiraceae [2].
    В исследовании Yang et al. [16] проведено сравнение микробиоты желудка у двух генетически различных популяций людей в Колумбии, проживающих в городах Тукеррес и Тумако. У первых частота рака желудка была в 25 раз выше, чем у вторых, несмотря на одинаковую распространенность инфекции НР. Оказалось, что состав нехеликобактерной микробиоты желудка у них отличался: у жителей Тукерреса было обнаружено повышение численности Leptospira и Veillonella spp., а у людей из Тумако преобладали Staphylococcus spp.
    Таким образом, НР и нехеликобактерная микробиота желудка в совокупности играют важную роль в процессе канцерогенеза. По мере прогрессирования морфологических изменений в желудке меняется и микробиологический состав его обитателей, что может ускорить реализацию предраковых изменений и канцерогенез.
   С учетом этих данных можно предположить, что изменение микроэкологического окружения НР может повлиять на активность хронического гастрита, инициированного им, прогрессирование атрофии и риск развития рака желудка. Достичь изменений микробиоты желудка в целом возможно с помощью пробиотиков.

    Собственное исследование

    Целью нашего исследования стало изучение состава микробиоты желудка у НР-инфицированных детей в сравнении с неинфицированными, ранее не получавшими лечения.

    Материал и методы исследования

    Исследование проводилось в гастроэнтерологическом отделении СПб ГБУЗ «ДГКБ № 5 им. Н.Ф. Филатова» в 2015–2017 гг. у 16 детей в возрасте от 9 до 17 лет, направленных на эндоскопическое исследование в связи с симптомами диспепсии (рецидивирующие боли и дискомфорт в верхних отделах живота). После проведения верхней эндоскопии у 8 НР(+) больных, ранее не получавших антибиотики и пробиотики, были взяты биоптаты слизистой оболочки желудка для оценки состава микробиоты методом секвенирования. Для сравнения состава микробиоты желудка при отсутствии НР в исследование включены также 8 детей, у которых после проведения верхней эндоскопии и уточнения НР-статуса не выявлен НР.
    Для изучения состава микробиоты желудка у НР(+) детей в сравнении с неинфицированными до начала терапии мы провели определение бактериального метагенома биоптатов слизистой оболочки желудка. У 16 детей (8 НР(+) и 8 НР(-)) во время проведения эндоскопии дополнительно были взяты по 1 биоптату из антрального отдела желудка, у 2 детей — еще и из тела желудка для изучения их бактериального состава методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК с парой олигонуклеотидных праймеров, специфичных для консервативных участков на секвенаторе Life Technologies Ion Torrent с использованием чипа 318v2. Исследование было выполнено в Ресурсном центре Санкт-Петербургского государственного университета.

    Результаты исследования

    Результаты анализа таксономических групп  микробов в метагеноме желудка НР(+) детей

    Анализ показал неоднородность таксономического состава микробиоты желудка у обследованных детей, что представлено на рисунке 1.

    Доминирующими типами (phylum) бактерий в желудке детей с хроническим гастритом были Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, в меньшей степени были представлены Actinobacteria, Cyanobacteria, Fusobacteria. У всех детей, независимо от наличия НР, превалировали представители Proteobacteria. Однако у НР(+) больных он составлял в среднем 64,1% всего микробиома, а среди Proteobacteria достигал 75–99%, количество клонов других бактерий при этом значительно сокращалось, а видовое разнообразие уменьшалось.
    У 5 из 8 НР(+) пациентов НР существенно доминировал как среди всех микробов, так и среди Proteobacteria. Как представлено на рисунке 2, образцы 1.1, 1.2, 10.1, 13.1 и 7.1 отличаются высокой долей класса Epsilonproteobacteria. На уровне порядков у этих образцов сохраняется сдвиг в сторону Campylobacterales, на уровне семейств — Helicobacteraceae, на уровне родов — Helicobacter. Микробный состав слизистой оболочки желудка одного из таких пациентов представлен на рисунке 3, заметно доминирование в микробиоме НР (образец 10.1).


    Следует отметить, что эндоскопически у всех 5 пациентов с доминированием НР отмечалась выраженная нодулярность (nodularity) в антральном отделе желудка, а по данным гистологического обследования — высокая степень обсемененности НР (более 50 микробных тел в поле зрения). У этих больных отмечена высокая активность воспаления, у всех — выраженная лимфоидная гиперплазия, у 3 из 5 — признаки очаговой атрофии в антральном отделе желудка.
    У 3 НР(+) больных, по данным секвенирования, НР не был доминирующим микробом, представительство других микробов было более разнообразным, в т. ч. внутри группы Proteobacteria. Эндоскопически и гистологически признаки воспаления в желудке были незначительными, гистологически отмечалась низкая степень обсемененности НР (менее 20 микробных тел в поле зрения) с преобладанием кокковых форм в ямках. Микробный состав слизистой оболочки желудка одного из таких пациентов представлен на рисунке 4 (образец 14.1).

    Результаты анализа таксономических групп микробов в метагеноме желудка НР(-) детей

    В эндоскопической картине 8 НР(-) пациентов доминировал поверхностный гастрит, гистологически хроническое воспаление имело умеренную или низкую активность.
Микробиологический состав биоптатов желудка HР(-) больных несущественно отличался от биоптатов HР(+) больных с минимальной степенью обсемененности HР, но значительно отличался от биоптатов больных с высокой степенью обсемененности HР. Это особенно очевидно при анализе состава микробиоты на уровне порядков (рис. 5).

    Кластерный анализ, представленный на рисунке 6, демонстрирует, что состав микробиоты НР(+) пациентов образует два кластера: один — отдельный (больные с доминированием НР), другой — близкий к НР(-) пациентам — пациенты со слабой степенью обсемененности НР. Можно предположить, что дети со слабой степенью обсемененности имеют меньшую продолжительность НР-инфекции, поэтому окружающий микробиом еще не успел претерпеть существенные изменения, а морфологические признаки хронического гастрита пока минимальны.

    Взаимосвязь состава микробиоты и выраженности морфологических изменений слизистой оболочки желудка

    Наше исследование состава микробиоты желудка у детей с хроническим гастритом подтвердило существующие данные, полученные у взрослых, о том, что инфицирование НР меняет весь микробиологический состав желудка в целом. Эти изменения нарастают по мере увеличения длительности заболевания и коррелируют с выраженностью морфологических изменений слизистой оболочки желудка — воспалением и атрофией. У НР(+) детей, подобно взрослым [1], нами выявлены снижение видового разнообразия бактерий желудка, доминирование Proteobacteriae. Известно, что и НР, и другие представители Proteobacteriae обладают значительной провоспалительной активностью, усиливают процессы пролиферации и апоптоза. Поэтому у больных с высокой степенью обсемененности НР отмечены большая степень подавления другой микробиоты желудка и более выраженные воспалительные изменения слизистой оболочки, в ряде случаев — начальные признаки атрофии. У детей с незначительной степенью обсемененности НР окружающая микробиота желудка была более сохранна и разнообразна (возможно, в результате недавнего инфицирования НР), приближаясь по составу к показа-
телям НР(-) детей. Как результат, у этих пациентов и воспалительные изменения слизистой оболочки желудка были менее выраженными. То есть микробиологический состав слизистой оболочки желудка как комплексная экологическая система регулирует процесс воспаления, регенерации эпителия и создает условия для развития и прогрессирования патологии либо, напротив, предотвращает ее.
    Если стратегия традиционной эрадикационной терапии с применением двух антибиотиков нацелена на устранение НР, но при этом сопровождается дальнейшим нарушением микроэкологии желудка в целом, то концепция пробиотической терапии, особенно монотерапии, направлена на длительную и постепенную коррекцию микробиоты желудка. Главным итогом такого подхода становится не столько устранение НР как такового, хотя и эта задача достижима при условии длительного назначения эффективного пробиотика, сколько прерывание прогрессирования патологического каскада и восстановление слизистой оболочки желудка. Эта стратегия, по нашему мнению, особенно приемлема в детском возрасте, поскольку на ранних стадиях хронического гастрита она дает возможность полного гистологического восстановления слизистой оболочки и обеспечивает благоприятный длительный прогноз, что особенно важно для профилактики более тяжелой патологии: язвенной болезни и рака желудка.

    Заключение

    Дальнейшие исследования могут быть направлены на поиск более эффективных штаммов и микробных метаболитов, оценку более длительного и регулярного приема пробиотических продуктов, что в конечном итоге может принципиально поменять концепцию антихеликобактерной терапии и снизить риск развития более тяжелых форм НР-ассоциированной патологии.

---

Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.

---

---

---