Блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом магистральных артерий и ишемической формой синдрома диабетической стопы
DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-7-452-456
Цель исследования: оценить состояние сосудистого русла и блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов при атеросклерозе сосудов нижних конечностей и ишемической форме синдрома диабетической стопы (СДС).
Материал и методы: в ходе проспективного исследования было обследовано 75 пациентов (из них 51 (68%) женщина) с ишемической формой СДС и признаками хронического облитерирующего заболевания артерий нижних конечностей. В большинстве (92%) наблюдений ишемическая форма СДС развилась на фоне сахарного диабета 2 типа. Нарушения кровотока соответствовали II–III стадии по классификации Фонтейна — Покровского, язвенные дефекты — 1–2-й степени по классификации PEDIS, без признаков инфицирования и с признаками местного воспаления. Контрольную группу составили 25 здоровых лиц. Оценивали состояние сосудистого русла (методом ультразвуковой допплерографии артерий нижних конечностей) и степень компенсации сахарного диабета (по уровню гликированного гемоглобина), а также состояние мембраны лимфоцитов.
Результаты исследования: у 72% пациентов наблюдалась полная окклюзия берцово-стопного сегмента, у 28% — стеноз. Уровень гликированного гемоглобина составил 10,3 [8,5; 14,3]%, что свидетельствовало о недостаточной компенсации нарушений углеводного обмена. Суммарный и терминальный блеббинг составил 30,1 [25,4; 33,2]% и 15,8 [11,8; 18,4]%, что в 3 и 5 раз соответственно превышало показатели контрольной группы. Отмечена высокая положительная корреляция между уровнем гликированного гемоглобина и суммарным (rS=0,72; p=0,001) и терминальным (rS=0,78; p=0,001) блеббингом мембраны лимфоцитов.
Заключение: учитывая наличие высокой корреляционной связи между показателем гликированного гемоглобина и блеббингом плазматической мембраны лимфоцита, можно использовать повышение уровня гликированного гемоглобина как маркер развития эндотелиальной недостаточности при атеросклерозе сосудов нижних конечностей и ишемической форме СДС. В то же время уровень суммарного и терминального блеббинга можно рассматривать как патогенетический маркер макроангиопатии.
Ключевые слова: сахарный диабет, атеросклероз, ишемия, гемодинамика, блеббинг, гликированный гемоглобин.
Для цитирования: Дунаевская С.С., Хачатрян А.Т., Деулина В.В. Блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом магистральных артерий и ишемической формой синдрома диабетической стопы. РМЖ. Медицинское обозрение. 2020;4(7):452-456. DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-7-452-456.
S.S. Dunaevskaya, A.T. Khachatryan, V.V. Deulina
Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky,
Krasnoyarsk, Russian Federation
Aim: to assess the blood flow state and the lymphocyte plasma membrane blebbing in atherosclerosis of the lower limb arteries and the ischemic diabetic foot (IDF).
Patients and Methods: 75 patients (51 (68%) of them — women) underwent a prospective study with IDF and signs of chronic obliterating disease of lower limb arteries. In the majority of cases (92%), IDF occurred in the setting of type 2 diabetes mellitus. Blood circulation disorder corresponded to the stage II–III Fontaine–Pokrovsky classification, ulcerative defects — to the PEDIS grade 1–2 without signs of infection and with signs of local inflammation. The control group consisted of 25 healthy patients. Blood flow state (using Doppler ultrasound of the lower limb arteries) and diabetes mellitus compensation degree (by the level of glycated hemoglobin), as well as the lymphocyte membrane state were evaluated.
Results: 72% of patients had a total occlusion of tibial and foot segments, 28% — stenosis. The level of glycated hemoglobin was 10.3 [8.5; 14.3]%, which indicated insufficient compensation of carbohydrate metabolism disorders. Total and terminal blebbing was 30.1 [25.4; 33.2]% and 15.8 [11.8; 18.4]%, which was 3 and 5 times higher than the control group, respectively. A high positive correlation was observed between the level of glycated hemoglobin and total (rS=0.72; p=0.001) and terminal (rS=0.78; p=0.001) lymphocyte membrane blebbing.
Conclusion: given the presence of a high correlation between the indicator of glycated hemoglobin and lymphocyte plasma membrane blebbing, an increase in glycated hemoglobin can be used as a marker for the development of endothelial insufficiency in atherosclerosis of the lower limbs and IDF. At the same time, the level of total and terminal blebbing can be considered as a pathogenetic marker of macroangiopathy.
Keywords: diabetes mellitus, atherosclerosis, ischemia, hemodynamics, blebbing, glycated hemoglobin.
For citation: Dunaevskaya S.S., Khachatryan A.T., Deulina V.V. Blebbing of plasma membrane of lymphocytes in patients with atherosclerosis of main arteries and ischemic form of diabetic foot syndrome. Russian Medical Inquiry. 2020;4(7):452–456. DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-7-452-456.
Введение
Актуальность изучения проблемы заболеваний артерий и их осложнений обусловлена высокой распространенностью сосудистых нарушений в мире. Патогенез данной группы заболеваний многогранен, а перечень их видов и характер клинических проявлений очень широк, однако лидирующими остаются атеросклероз сосудов нижних конечностей и сосудистые осложнения сахарного диабета (СД) [1–3].
В 2000 г. распространенность СД в мире составляла 2,8% — это 171 млн человек. Учитывая неуклонный рост заболеваемости, по мнению экспертов, к 2030 г. СД поразит 4,4% населения земного шара — 366 млн человек [4]. У пациентов с СД риск развития незаживающих язв на фоне синдрома диабетической стопы (СДС) составляет 25%, при наличии одного из дополнительных факторов риска, например облитерирующего заболевания сосудов нижних конечностей, риск повышается до 50% [5–7].
Течение СДС, особенно ишемической формы, напрямую зависит от состояния регионарного кровотока, и в частности от уровня и степени поражения артерий нижних конечностей. При неблагоприятном исходе заболевания развиваются трофические нарушения и гангрена нижней конечности, которые зачастую обусловлены гемодинамическими нарушениями магистрального и коллатерального кровотока [8, 9].
Основой патогенеза развития хронической артериальной ишемии служит эндотелиальная дисфункция сосудистой стенки [10, 11]. Оценка степени эндотелиальной недостаточности проводится инструментальными (оценка сужения артерий крупного и среднего калибра [12, 13]) и лабораторными (определение показателей гомоцистеина, гемостаза и блеббинга плазматической мембраны клеток, и в частности лимфоцитов) методами исследования [14, 15].
Исследование эндотелиальной функции, регулирующей динамический баланс констрикторных и релаксирующих факторов, а также ангиопротективных и пролиферативных медиаторов, секретируемых эндотелием, позволяет судить о регионарном кровообращении. Ранее проводились исследования, посвященные изучению эндотелиальной дисфункции при развитии атеросклероза сосудов нижних конечностей. Однако исследований, в которых проводилась бы комплексная оценка эндотелиальной функции при наличии атеросклероза сосудов нижних конечностей и ишемической формы СДС, в доступной литературе нам не встретилось.
Цель исследования: оценить состояние сосудистого русла и блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов при атеросклерозе магистральных артерий и ишемической форме СДС.
Материал и методы
Работа основана на проспективном анализе 75 пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей и ишемической формой СДС, находившихся в хирургическом отделении КГБУЗ «КМКБ № 7» в период 2019–2020 гг. Критерии включения в исследование: II–III стадия артериальной ишемии по классификации Фонтейна — Покровского, язвенные дефекты 1–2-й степени по классификации PEDIS. У всех пациентов были выявлены поверхностные и глубокие язвенные дефекты площадью от 1,5 см2 до 3 см2 с локализацией, характерной для ишемической формы СДС. В период рассматриваемой госпитализации реконструктивные операции были не показаны вследствие мультиэтажного поражения артерий.
Мужчин было 24 (32%), женщин — 51 (68%), медиана возраста составила 71 [69; 72] год.
У большинства — 69 (92%) пациентов ишемическая форма СДС развилась на фоне СД 2 типа, у 6 (8%) пациентов — на фоне СД 1 типа. Давность заболевания СД составила 15,4±3,9 (M±σ) года.
В контрольную группу вошли 25 здоровых лиц, сопоставимых с исследуемой группой по возрасту и полу.
Для объективной оценки сохраненного просвета сосудов нижних конечностей всем пациентам выполняли ультразвуковую допплерографию артерий с помощью ультразвукового сканера «ALOKA ALPHA 7 ProSound» (Aloka, Япония) и при невозможности обследования сосуда на всем его протяжении вследствие неравномерного залегания отдельных участков артерий проводили компьютерную ангиографию с помощью мультиспирального 4-срезового компьютерного томографа «Lightspeed Plus» (General Electric, США). Для оценки компенсации СД определяли уровень гликированного гемоглобина методом капиллярного электрофореза на приборе «Capillarys-2 Flex Piercing» (SEBIA, Франция).
Состояние мембраны лимфоцитов оценивали на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Культуру клеток выделяли по стандартной методике посредством центрифугирования периферической крови по градиенту плотности с Lympholyte H CL5010 (Cedarlane Laboratories Limited, Канада). Визуализацию осуществляли методом фазово-контрастной микроскопии на микроскопе «Olympus BX-41». Определяли число лимфoцитов в состоянии начального блеббинга (мелкие везикулы на плазматической мембране, занимающие до 1/3 радиуса клетки), число лимфoцитов в состоянии терминального блеббинга (крупные множественные везикулы плазматическoй мембраны, занимающие более 1/3 радиуса), а также оценивали суммарный блеббинг — количество клетoк в состоянии начального и терминального блеббинга в процентах от oбщего числа лимфоцитов (не менее 30 пoлей зрения, при этом подсчет велся на 100 выделенных лимфoцитах).
Базовое консервативное лечение проводили согласно национальным рекомендациям по ведению пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей (2013 г.). Инфузионная терапия включала препараты, улучшающие микроциркуляцию, спазмолитики, витамины, никотиновую кислоту, антиагреганты, статины. При отсутствии противопоказаний пациентам назначали физиотерапию. Все пациенты получали гипогликемическую терапию, коррекцию осуществляли совместно с эндокринологом.
Описательная статистика представлена в виде медианы и 25-го и 75-го перцентилей: Ме [Q1; Q3]. Характер распределения полученных величин оценивали на основании теста Шапиро — Уилка. Большинство величин не соответствовали нормальному распределению, поэтому для попарного сравнения применяли непараметрический U-критерий Манна — Уитни. Критический уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотезы считали равным 0,05 (р=0,05). Взаимосвязь между признаками и степенью их выраженности исследовали с помощью множественного регрессионного анализа, вычисляли коэффициенты корреляции (rS) Спирмена, Гамма и Кен-дал-Тау и уровни их значимости.
Результаты исследования
При оценке проходимости сосудистого русла и функционального состояния кровоснабжаемых тканей выявлено преимущественное поражение артерий голени: задней большеберцовой и передней большеберцовой (табл. 1). Толщина комплекса интима–медиа составила 0,84 [0,82; 0,88] мм.
В исследуемой группе наблюдалось преимущественное поражение сосудов берцового сегмента и стоп, что определяло клиническое течение заболевания. Уменьшение диаметра исследуемых артерий определялось в 72% как окклюзия и в 28% как стеноз.
У части пациентов было диагностировано сужение просвета артерий подколенного и берцового сегментов, в 56% случаев диагностирован стеноз, в 40% случаев — окклюзия (табл. 2).
Для оценки компенсации СД и верификации риска развития макрососудистых осложнений оценивали целевые показатели гликированного гемоглобина, уровень которого составил 10,3 [8,5; 14,3]%.
Характеризуя блеббинг лимфоцитов у больных с ишемической формой СДС, следует отметить, что содержание лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга в периферической крови превышало такой же показатель в контрольной группе в 5 раз и составляло 15,8 [11,8; 18,4]% (р=0,001). Известно, что терминальный блеббинг является необратимым процессом апоптоза лимфоцитов. Суммарный блеббинг у пациентов с ишемической формой СДС составил 30,1 [25,4; 33,2]% (р=0,001), что в 3 раза превышало показатель в контрольной группе Выявлена высокая положительная корреляция между уровнем гликированного гемоглобина и суммарным (rS=0,72; -0,001) и терминальным (rS=0,78; p=0,001) блеббингом плазматической мембраны лимфоцитов (табл. 3).
Обсуждение
Эндотелиальная дисфункция играет огромную роль в развитии макро- и микроангиопатических осложнений при атеросклерозе сосудов нижних конечностей и СДС [11]. В связи с этим оценка выраженности эндотелиальной дисфункции является актуальной при определении сос-тояния сосудистого русла и прогнозировании течения заболевания.
Наиболее часто для оценки функционального состояния эндотелия определяют содержание оксида азота, растворимой формы молекулы межклеточной адгезии sPECAM-1 и число слущенных эндотелиоцитов и прогениторных клеток [14]. Однако оксид азота является нестойким соединением, и его косвенное определение дает ряд погрешностей. Иммуноферментный анализ уровня sPECAM-1 имеет высокую стоимость и выполняется на большом числе проб, что затрудняет его проведение при малом количестве обследуемых пациентов. Перспективным исследованием можно считать оценку блеббинга лимфоцитов, формирование микрочастиц различного клеточного происхождения и экспрессию различных рецепторов клетками крови и эндотелиоцитами [6, 12].
Блеббинг лимфоцитов является уникальным иммунологическим процессом. В результате активации лимфоцита вследствие повреждения сосудистой стенки на поверхности мембраны формируются выпячивания вследствие диссоциации белков цитоскелета. При этом формируются и высвобождаются свободные активные мембранные микрочастицы лимфоцитарного происхождения. Доказана важность изучения лимфоцитарных микрочастиц при сосудистой патологии и их влияния на прогрессирование атеросклеротического процесса [15]. Также отмечена роль циркулирующих микрочастиц при формировании сосудистых осложнений СД [10]. Таким образом, блеббинг лимфоцитов как источник формирования активных циркулирующих микрочастиц является патогенетическим маркером нарушения функционального состояния эндотелия.
Неблагоприятное течение ишемической формы СДС на фоне атеросклеротического процесса в большей степени обусловлено развитием и прогрессированием макроангиопатии [7]. Диагностически значимыми факторами при данной патологии являются уровень и степень поражения магистральных сосудов, а также показатели гликированного гемоглобина [8]. Проведя корреляционный анализ между основными показателями блеббинга лимфоцитов и уровнем гликированного гемоглобина, можно предположить, что повышенный уровень суммарного и терминального блеббинга лимфоцитов является чувствительным маркером развития и прогрессирования гипоксии, которая присутствует при ишемической форме СДС. Таким образом, уровень суммарного и терминального блеббинга может служить патогенетическим маркером макроангиопатии при данном заболевании.
Заключение
В ходе проведенного исследования у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей и ишемической формой СДС было зарегистрировано повышение уровня гликированного гемоглобина на фоне увеличения показателей терминального и суммарного блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов. Вероятнее всего развитие и прогрессирование эндотелиальной дисфункции было связано с недостаточной компенсацией СД. Учитывая наличие высокой корреляционной связи между показателем гликированного гемоглобина и блеббингом плазматической мембраны лимфоцита, можно использовать повышенный уровень гликированного гемоглобина как маркер развития эндотелиальной недостаточности при атеросклерозе сосудов нижних конечностей и ишемической форме СДС. Возможно, декомпенсация СД приводит к прогрессированию атеросклероза магистральных артерий и СДС и формированию трофических расстройств в области нижних конечностей. Перспективным представляется изучение особенностей изменения показателя блеббинга плазматической мембраны лимфоцита при нормальных показателях гликированного гемоглобина.
Сведения об авторах:
Дунаевская Светлана Сергеевна — д.м.н., профессор, профессор кафедры общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. Войно-Ясенецкого Минздрава России; 660022, Россия, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1; ORCID iD 0000-0003-2820-4737.
Хачатрян Айк Тигранович — очный аспирант кафедры общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. Войно-Ясенецкого Минздрава России; 660022, Россия, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1; ORCID iD 0000-0001-5818-1631.
Деулина Вера Валерьевна — к.м.н., ассистент кафедры общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. Войно-Ясенецкого Минздрава России; 660022, Россия, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1; ORCID iD 0000-0002-7515-0500.
Контактная информация: Дунаевская Светлана Сергеевна, e-mail: Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 11.09.2020, поступила после рецензирования 25.09.2020, принята в печать 09.10.2020.
About the authors:
Svetlana S. Dunaevskaya — Dr. of Sci. (Med.), Professor of the Department of General Surgery named after Prof. M.I. Gulman, Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. Voino-Yasenetsky: 1, Partisana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-2820-4737.
Aik T. Khachatryan — post-graduate student of the Department of General Surgery named after Prof. M.I. Gulman, Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. Voino-Yasenetsky: 1, Partisana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-5818-1631.
Vera V. Deulina — Cand. of Sci. (Med.), Assistant Professor of the Department of General Surgery named after Prof. M.I. Gulman, Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. Voino-Yasenetsky: 1, Partisana Zheleznyaka str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-7515-0500.
Contact information: Svetlana S. Dunaevskaya, e-mail: Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 11.09.2020, revised 25.09.2020, accepted 09.10.2020.
2. Muhtaroğlu S., Barlak Keti D., Ünlühizarci K. Investigation of ischemia-modified albumin levels and some atherosclerosis-related serum parameters in patients with diabetic foot. Turk J Med Sci. 2016;46(1):126–132. DOI: 10.3906/sag-1406-38.
3. Suades R., Padró T., Alonso R. et al. Circulating CD45+/CD3+ lymphocyte-derived microparticles map lipid-rich atherosclerotic plaques in familial hypercholesterolaemia patients. Thromb Haemost. 2014;111(1):111–121. DOI: 10.1160/TH13-07-0612.
4. Wild S., Roglic G., Green A. et al. Global prevalence of diabetes — Estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 2004;27(5):1047–1053. DOI: 10.2337/diacare.27.5.1047.
5. Дунаевская С.С., Винник Ю.С. Развитие эндотелиальной дисфункции при облитерирующем атеросклерозе сосудов нижних конечностей и маркеры прогнозирования течения заболевания. Бюллетень сибирской медицины. 2017;16(1):108–118. DOI: 10.20538/1682-0363-2017-1-108-118.
6. Инжутова А.И., Ларионов А.А., Салмина А.Б., Петрова М.М. Молекулярно-клеточные механизмы эндотелиальной дисфункции различного генеза (сообщение 1). Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2010;96(5):85–88.
7. Boulton A.J., Armstrong D.G., Albert S.F. et al. Comprehensive foot examination and risk assessment: A report of the Task Force of the Foot Care Interest Group of the American Diabetes Association, with endorsement by the American Association of Clinical Endocrinologists. Diabetes Care. 2008;31(8):1679–1685. DOI: 10.2337/dc08-9021.
8. Максимов А.В., Гайсина Э.А., Нуретдинов Р.М. Периоперационный контроль эффективности эндоваскулярных реконструкций берцовых артерий при ишемической форме синдрома диабетической стопы. Практическая медицина. 2015;4–1(89):93–96.
9. Alexandru N., Badila E., Weiss E. et al. Vascular complications in diabetes: Microparticles and microparticle associated microRNAs as active players. Biochem Biophys Res Commun. 2016;472(1):1–10. DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.02.038.
10. Герасимчук П.А., Кисиль П.В., Власенко В.Г., Павлышин А.В. Показатели эндотелиальной дисфункции у больных с синдромом диабетической стопы. Вестник РАМН. 2014;5–6:107–110.
11. Qin D., Zhang L., Chang N. et al. In situ observation of single cell response to acoustic droplet vaporization: Membrane deformation, permeabilization, and blebbing. Ultrason Sonochem. 2018;47:141-150. DOI: 10.1016/j.ultsonch.2018.02.004.
12. Budzyń M., Gryszczyńka B., Boruczkowski M. et al. The endothelial status reflected by circulating endothelial cells, circulating endothelial progenitor cells and soluble thrombomodulin in patients with mild and resistant hypertension. Vascul Pharmacol. 2019;113:77-85. DOI: 10.1016/j.vph.2018.12.005.
13. Jiang L., Lin L., Li R. et al. Dimer conformation of soluble PECAM-1, an endothelial marker. Int J Biochem Cell Biol. 2016;77(PtA):102–108. DOI: 10.1016/j.biocel.2016.06.001.
14. Krishnan S., Nash F., Baker N. et al. Reduction in diabetic amputations over 11 years in a defined UK population: benefits of multidisciplinary team work and continuous prospective audit. Diabetes Care. 2008;31(1):99–101. DOI: 10.2337/dc07-1178.
15. Shi Y., Vanhoutte P.M. Macro- and microvascular endothelial dysfunction in diabetes. J Diabetes. 2017;9(5):434–449. DOI: 10.1111/1753-0407.12521.
Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.
