Комплексная оценка эффективности генно-терапевтического лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей

Статья посвящена оценке эффективности консервативного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генно-инженерной терапии.

   Введение

    Одной из самых часто встречаемых сердечно-сосудистых патологий в популяции являются хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей, вызывающие развитие хронической ишемии.
    Заболевания периферических артерий составляют 3–4% от числа всех хирургических заболеваний. Распространенность перемежающейся хромоты в зависимости от возраста варьируется от 0,9 до 7,0% с увеличением в старших возрастных группах (1–5% у лиц моложе 50 лет, 10–14% — среди людей 50–70 лет) [1]. Хирургические методы лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей продолжают стремительно развиваться, постоянно увеличивается доля рентгенэндоваскулярных вмешательств. Говоря же о консервативном лечении, достоверных выводов о пользе тех или иных фармакологических препаратов сделать нельзя. Очевидными столпами консервативного лечения остаются лечебная физическая культура и корректировка факторов риска, но что касается препаратов, чье действие направлено непосредственно на лечение перемежающейся хромоты, то имеющиеся исследования не свидетельствуют о пользе какого-либо из них [2]. Главная причина этого — отсутствие объективных критериев, на основании которых можно было бы сравнивать существующие схемы консервативного лечения. Проводились исследования, которые оценивали морфологические изменения в структуре мышц пораженной конечности, однако значительных различий между контрольной группой и группой консервативного лечения получено не было [3]. Также существуют исследования, которые оценивали функции нервов [4], изменения в метаболизме АДФ, фосфокреатинина [5] в биоптате пораженной конечности, но и при оценке этих факторов не было получено каких-либо значимых различий между контрольной и исследуемой группами.
    Действие большинства препаратов для лечения перемежающейся хромоты, используемых в актуальных схемах, направлено на корректировку симптомов, не на этиологию и патогенез заболевания. Одним из немногих методов, которые оказывают влияние на патогенез развития хронической ишемии нижних конечностей, являются генно-терапевтические технологии. Стимуляцию ангиогенеза на генетическом уровне можно считать перспективным направлением развития терапии некоторых заболеваний, в частности перемежающейся хромоты. К настоящему моменту существуют исследования использования различных факторов роста для лечения:
    фактор роста эндотелия (VEGF, изоформы: VEGF-A до -E) [6, 7];
    факторы роста плаценты (PLGF, изоформы: PLGF-1 и -2);
    факторы роста фибробластов (FGF, изоформы: 
23 от FGF-1 до FGF-23) [8];
    факторы роста гепатоцитов (HGF, изоформы HGF/NK1 и HGF/NK2) [9];
    факторы роста, полученные из тромбоцитов (PDGF, изоформы: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC и -DD);
    ангиопротеин (Ang, изоформы: Ang-1, -2, -3, и -4);
    эритропоэтин (EPO).
    При ишемии конечностей препараты на основе гена VEGF 165 лидируют как по критериям безопасности, так и по эффективности, поскольку эта изоформа VEGF-А, состоящая из 165 аминокислот, обладает наибольшим митотическим эффектом по сравнению с остальными изоформами. Наиболее безопасной стратегией переноса нужного гена в клетки-мишени является использование невирусных систем, в частности плазмид. Плазмиды — экстрахромосомные кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, обнаруживаемые в клетках бактерий и давно ставшие одним из самых распространенных инструментов генной инженерии. При любом способе введения отмечается экспрессия трансгена в мышечных волокнах ишемизированной ткани, локальное повышение концентрации продуцируемого белка, в частности VEGF, и улучшение перфузии тканей за счет развития новых капилляров.
    Первым зарегистрированным в РФ генно-терапевтическим препаратом на основе плазмиды является Неоваскулген (РУ № ЛП-000671 от 28.09.2011). Он представляет собой высокоочищенную сверхскрученную форму плазмиды pCMV–VEGF165, кодирующую эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF — vascular endothelial growth factor) под контролем промотора (управляющего участка ДНК). Препарат рекомендуется вводить внутримышечно в среднюю или нижнюю треть задней поверхности икроножной мышцы [6]. Имеются исследования, которые говорят о положительном влиянии данного препарата на субъективные показатели оценки, такие как максимально проходимая дистанция [6] в ближайшем (3 мес.) и отдаленном периоде (до 5 лет) [10].
    Целью настоящей работы явилась оценка эффективности консервативного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (ХИНК) с использованием генно-инженерной терапии (препарат Неоваскулген) на основании комплекса как субъективных, так и объективных критериев. Из объективных критериев использовались гистохимические (определение BNIP3 — BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3, проапоптозный белок семейства B-клеточных лимфом 2 (BCL2) в биоптате икроножной мышцы пораженной конечности) и биохимические (определение фактора роста эндотелия (VEGF-А) в периферической крови, непосредственно оттекающей от ишемизированных мышц).
    Фактор роста эндотелия VEGF-А представляет собой сигнальный белок, вырабатываемый клетками для стимулирования васкулогенеза (образование эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе).
    Определение маркеров апоптоза (BNIP3) в биоптате икроножной мышцы пациентов позволяет оценить морфологические и гистологические изменения в пораженной конечности. Выраженность апоптоза используют для оценки уровня ишемии органов: так, например, существуют исследования, четко указывающие, что апоптоз кардиомиоцитов играет наиважнейшую роль в прогрессировании ишемической болезни сердца и острого инфаркта миокарда [11]. 
В нашей ранее опубликованной работе представлены данные, указывающие на прямую зависимость между степенью ишемии конечности и экспрессией BNIP3 с достижением максимальных значений на IIБ стадии заболевания по классификации Покровского — Фонтейна, когда максимально активизируется программируемая смерть клетки [12].

   Материал и методы

   
В исследование были включены 49 пациентов с различными стадиями ХИНК в соответствии с классификацией Покровского — Фонтейна. Пациенты были разделены на 2 группы, в каждой из групп были пациенты с I, II, III и IV стадиями ишемии (табл. 1). Несмотря на то, что основной целевой группой лечения генно-терапевтическими препаратами являются пациенты с перемежающейся хромотой, соответствующей II стадии ишемии по классификации Покровского — Фонтейна, в исследование также включались пациенты с начальными изменениями и с критической ишемией. Пациенты с I стадией ишемии не требуют специфического лечения хронической артериальной недостаточности, но их включение в исследование было необходимо для оценки степени выраженности изменений, происходящих в ишемизированных тканях на гистохимическом уровне на каждом из этапов развития основного заболевания. По этой же причине в исследовании принимали участие пациенты с ишемией, угрожающей жизнеспособности конечности, соответствующей III и IV стадиями ишемии по классификации Покровского — Фонтейна. Группа 1 получала терапию в соответствии с Национальными рекомендациями по ведению пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей, которая включала: антитромбоцитарную (ацетилсалициловая кислота 100 мг), липидоснижающую (аторвастатин 10 мг), гипотензивную (бисопролол 2,5 мг) терапию. Терапия пациентов группы 2 была дополнена препаратом Неоваскулген, который вводился внутримышечно в ишемизированную зону икроножной мышцы двукратно по 1,2 мг с интервалом в 14 дней. Группы были сопоставимы по полу, возрасту, сопутствующей патологии и уровню поражения сосудистого русла (см. табл. 1). 

    Период наблюдения за пациентами составил 6 мес. Перед началом исследования пациентам выполнялись как лабораторные (общий анализ крови, биохимический анализ крови, коагулограмма, общий анализ мочи), так и инструментальные (цветное дуплексное сканирование (ЦДС) артерий нижних конечностей, определение лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ)) исследования. Для оценки эффективности проводимого лечения использовались как субъективные (оценка дистанции безболевой ходьбы (ДБХ)), так и объективные критерии оценки (определение фактора роста эндотелия (VEGF-А) в периферической крови, непосредственно оттекающей от ишемизированных мышц, определение BNIP3 в биоптате икроножной мышцы пораженной конечности). ДБХ оценивалась по данным тредмил-теста (скорость беговой дорожки 3 км/ч, угол наклона 10%). Фактор роста эндотелия определялся в венозной крови, взятой из v. marginalis lateralis на стопе пораженной конечности. Кровь для оценки местных изменений в конечности необходимо забирать именно из вен пораженной конечности в непосредственной близости от ишемизированных тканей, т. к. венозная кровь в различных участках организма существенно различается по общим показателям (таким как парциальное давление кислорода и углекислого газа), из чего можно сделать вывод, что и показатели ангиогенеза в разных зонах также отличаются. Биоптат икроножной мышцы был получен посредством пистолетной автоматической биопсии (использовался пистолет Sterylab Colt) икроножной мышцы на границе верхней и средней трети голени пораженной конечности [13]. Забор материала для биопсии необходим именно на этом уровне, т. к. пациенты в исследовании страдали «низкой» перемежаюшейся хромотой, проявлявшейся болями непосредственно в икроножных мышцах. Уровень VEGF-А в сыворотке крови оценивался с помощью иммуноферментного анализа с использованием реактивов RandD (США).
    Биопсия выполнялась в 1-й день исследования и через 6 мес. после начала. Материал фиксировался в двух различных средах: первая часть — в 10% растворе формалина, вторая часть — в фосфатном буфере с добавлением 2,5% раствора глутарового альдегида. Световая микроскопия полученного препарата проводилась с помощью микроскопа LeicaDM 2500. Окраска препаратов проводилась гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования использовались ткани, фиксированные в растворе формалина. Исследование проводилось на срезах толщиной 4–5 мкм на покрытых поли-L-лизином предметных стеклах. Использовали первичные поликлональные антитела к BNIP3 фирмы Santa Kruz Biotechnology (США) и набор реактивов для пероксидазной реакции UniversalLSAB2 DAKO (США). Результат оценивался следующим образом: 0 — реакция отсутствует, 1 — малое количество вступивших в реакцию клеток, 2 — умеренное количество, 3 — значительное количество.

   Результаты исследования

    Основными критериями оценки эффективности проводимого лечения были показатели ДБХ, определение VEGF-A в периферической крови, непосредственно оттекающей от ишемизированных мышц, и определение BNIP3 в биоптате икроножной мышцы пораженной конечности посредством электронной микроскопии. В группе 1 были зафиксированы неудовлетворительные результаты — какого-либо значимого изменения вышеуказанных показателей у пациентов отмечено не было.
    В группе 2 была зафиксирована динамика по всем показателям: отмечено увеличение ДБХ, повышение VEGF-A, а также достоверное уменьшение уровня BNIP3 (табл. 2, 3).


    Обращает на себя внимание высокий как начальный, так и через 6 мес. уровень VEGF у пациентов со IIА стадией по сравнению с таковым во всех других группах. Это объясняется тем, что IIА стадия является своего рода пограничной линией, когда компенсаторные механизмы задействованы максимально, в дальнейшем при прогрессировании заболевания сопротивление организма заболеванию снижается [13].
    Наилучшие результаты были получены у пациентов с начальными стадиями заболевания (стадии I и II по классификации Покровского — Фонтейна).

   Обсуждение

    В организме человека, как здорового, так и больного, процессы ангиогенеза и апоптоза идут постоянно, но при поражении артериального русла конечности с развитием хронической артериальной недостаточности в дальнейшем эти процессы меняют степень своей интенсивности. По результатам нашего исследования видно, что IIА стадия является пограничной степенью ишемии, когда морфофункциональные нарушения еще носят обратимый характер, поэтому именно в это время у пациентов максимально выражен ангиогенез. С прогрессированием заболевания морфологические и функциональные изменения становятся постоянными, поэтому компенсаторные возможности организма снижаются.
    Как в группе 1, так и группе 2 не было отмечено значимых побочных реакций, которые можно было бы ассоциировать с проводимым лечением. В результате исследования была отмечена положительная внутригрупповая динамика относительно исходных субъективных (ДБХ) и объективных (VEGF в периферической крови и BNIP3 в биоптате икроножной мышцы) параметров для группы, которая получала генно-терапевтическое лечение, при этом лучшие результаты были получены для пациентов с начальными проявлениями заболевания и с перемежающейся хромотой. У пациентов с критической ишемией нельзя говорить о значимой динамике — ни отрицательной, ни положительной. У пациентов группы 1, получавших стандартное лечение, какой-либо значительной динамики исследуемых показателей зафиксировано не было.
    Непосредственное лечение перемежающейся хромоты (генно-терапевтические препараты, ингибиторы фосфодиэстеразы, антигипоксические препараты) позволяет пациентам на протяжении определенного времени избегать развития критической ишемии. Большинство препаратов для непосредственного лечения хромоты не оказывают влияния на этиологию заболевания. Поэтому пациентам с критической ишемией (соответствующей III и IV стадии по классификации Покровского — Фонтейна) следует рекомендовать лечение в специализированных ангиохирургических стационарах, где основным методом лечения следует выбирать оперативное (открытое или рентгенэндоваскулярное). Говоря о консервативном лечении ишемии, угрожающей жизнеспособности конечности, следует отдавать предпочтение другим группам препаратов, в частности простагландинам.

   Заключение

    В нашем исследовании генетическая терапия препаратом Неоваскулген показала положительные результаты, и генно-терапевтическое лечение можно расценивать как одну из главных современных возможностей консервативного лечения пациентов с ХИНК, в частности с перемежающейся хромотой. Для включения данного препарата в «золотой стандарт» медикаментозного лечения ХИНК необходимо большее количество рандомизированных исследований, а также постоянное использование объективных критериев оценки качества проводимого консервативного лечения: биохимических (показатель уровня VEGF в периферической крови) и морфологических (показатель маркеров апоптоза (BNIP3) в биоптате икроножной мышцы пораженной конечности).

---

Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.

---

---

---