РМЖ Медицинское обозрение
ISSN 2587-6821 (Print), 2686-9918 (Online)

Полиморфизм генов, спонтанная и индуцированная продукция клетками периферической крови интерлейкина 4 и интерферона гамма при бронхиальной астме у детей

Импакт фактор - 0,378*

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ



РМЖ «Медицинское обозрение» №1 от 01.04.2020 стр. 10-14

DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-1-10-14

Рубрика: Аллергология

Цель исследования: характеристика полиморфизмов генов цитокинов — интерлейкина IL-4 (С-589Т) и интерферона IFNγ (874 A/T), спонтанной и индуцированной продукции клетками периферической крови цитокинов IL-4, IFNγ у детей с бронхиальной астмой (БА).

Материал и методы: в проспективное открытое исследование включены 60 детей в возрасте от 3 до 11 лет: 35 (58,33%) мальчиков и 25 (41,67%) девочек с верифицированным диагнозом БА в межприступный период и 100 сопоставимых по полу и возрасту здоровых сверстников. Определяли содержание в плазме и спонтанную и индуцированную продукцию клетками периферической крови IFNγ, IL-4, а также частоту встречаемости полиморфизма генов IFNγ (874А/Т), IL-4 (С-589Т). Материалом для исследования служила цельная кровь. Исследовали спонтанную и митоген-индуцированную продукцию IFNγ и IL-4 клетками цельной крови. Проводилось выделение геномной ДНК с дальнейшей оценкой генотипа IL-4 C-590T и генотипа IFNγ 874ТТ полимеразной цепной реакцией.

Результаты исследования: в группе детей с БА у преобладающего большинства (75%) выявлены генотипы IFNγ (874 A/А) и IL-4 (C-590T), а также низкие показатели спонтанной продукции IFNγ вне зависимости от генетических вариантов. У детей с БА активация индуцированной митогеном продукции IFNγ ассоциировалась с гетерозиготным носительством АТ, в группе гомозиготного носительства АА не зафиксировано адекватной индукции продукции цитокина. У здоровых детей не обнаружено достоверных различий содержания IFNγ в плазме, спонтанной и индуцированной продукции в зависимости от генетических вариантов изучаемых полиморфизмов. У детей с БА высокие показатели спонтанной и индуцированной продукции IL-4 клетками периферической крови ассоциировались с гомозиготным носительством ТТ и гетерозиготным носительством СТ.

Заключение: при анализе генетической вариации гена IFNγ протективный эффект выявлен при гаплотипе ТТ и гетерозиготном варианте АТ в отношении риска развития БА. Установлена связь между вариантами генотипов и синтеза цитокинов. Выявленные различия полиморфизма генов цитокинов при БА вносят вклад в изучение молекулярно-генетических основ формирования БА и могут быть использованы для персонификации терапии.

Ключевые слова: полиморфизм генов, интерферон гамма, интерлейкин 4, спонтанная и индуцированная продукция цитокинов, бронхиальная астма, дети.




Для цитирования: Просекова Е.В., Долгополов М.С., Сабыныч В.А. Полиморфизм генов, спонтанная и индуцированная продукция клетками периферической крови интерлейкина 4 и интерферона гамма при бронхиальной астме у детей. РМЖ Медицинское обозрение. 2020;1:10-14. DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-1-10-14.

E.V. Prosekova, M.S. Dolgopolov, V.A. Sabynych

Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation

Aim: to characterize interleukin 4 (IL-4) and interferon gamma (IFN-γ) gene polymorphisms (С-589Т and 874 A/T, respectively) and spontaneous and induced production of IL-4 and IFN-γ by peripheral blood cells in children with asthma.

Patients and Methods: 60 children aged 3–11 years (35 boys (58.33%) and 25 girls (41.67%)) with verified asthma between attacks and 100 sex- and age-matched healthy children were enrolled in this prospective open-label study. Plasma levels of IFNγ and IL-4 and their spontaneous and mitogen-induced production by peripheral blood cells were measured, and IL-4 (874А/Т) and IFN-γ (С-589Т) gene polymorphisms were studies. Whole blood was tested. Genome DNA was isolated, C-590T and 874TТ variants were characterized by polymerase chain reaction (PCR).

Results: in most children with asthma, 874 A/А (IFN-γ) and C-590T (IL-4) genotypes were identified (75%). Spontaneous production of IFN-γ was low irrespective of genetic variant. Activation of mitogen-induced IFN-γ production was associated with heterozygotic AT variant while no adequate mitogen-induced IFN-γ production was associated with homozygotic AA variant. Neither significant differences in plasma levels of IFN-γ nor its spontaneous and induced production depending on genetic variants of polymorphisms were revealed. In children with asthma, high levels of spontaneous and induced production of IL-4 by peripheral blood cells were associated with homozygotic TT variant and heterozygotic CT variant.

Conclusion: analysis of genetic variation of IFN-γ gene has demonstrated that TT haplotype and heterozygotic AT variant are characterized by protective effect in terms of asthma risk. Associations between genotype variants and cytokine synthesis were described. Differences in cytokine gene polymorphism in asthma contribute to unraveling molecular genetic basis of asthma. These knowledges may be used to design more personalized treatment regimens.

Keywords: gene polymorphism, interferon gamma, interleukin-4, spontaneous and induced production of cytokines, asthma, children.

For citation: Prosekova E.V., Dolgopolov M.S., Sabynych V.A. Gene polymorphism, spontaneous and induced production of interleukin 4 and interferon gamma by peripheral blood cells in children with asthma. Russian Medical Review. 2020;4(1):10–14. DOI: 10.32364/2587-6821-2020-4-1-10-14.

Введение

Аллергические заболевания органов дыхания входят в группу широко распространенных социально значимых мультифакториальных заболеваний [1–3].

Бронхиальная астма (БА) — хроническое гетерогенное заболевание, в развитии которого важную роль играют иммунологические механизмы [4, 5]. В процессе формирования иммунного ответа при аллергических заболеваниях участвуют основные и вспомогательные иммунокомпетентные клетки, различающиеся по антигенам главного комплекса гистосовместимости и продуцируемым цитокинам [6–9].

Мутации в генах цитокинов, дефекты продукции, рецепции и чрезмерная продукция отдельных цитокинов составляют значительную часть иммуноопосредованных механизмов развития и прогрессирования патологических процессов при аллергических заболеваниях [10].

Профиль продуцируемых цитокинов модулирует определенный тип клеточной кооперации, формирует вторичные эффекты Т-клеточной активации. Субпопуляции Т-хелперов (Тh) определяют направленность, специфичность и эффекторные механизмы иммунного ответа. Индукция выработки цитокинов антигеном и локальная концентрация метаболитов в лимфоидной ткани определяют дифференцировку Т-хелперов по пути Тh1, Тh2, Тh9, Тh17. Согласно современным представлениям нарушения иммунного гомеостаза с дисбалансом в соотношении Th1/Th2 лимфоцитов определяют тип иммунного реагирования и являются основой формирования аллергического воспаления при БА [11, 12].

В патогенезе БА значима роль баланса цитокинов — интерферона гамма (IFNγ) и интерлейкина IL-4, определяющих поляризацию иммунного ответа и профиль Тh1 и Тh2. IFNγ продуцируется активированными Тh1, T-цитотоксическими и натуральными киллерами (Natural killer cells — NK-клетки). IFNγ участвует в клеточном иммунном ответе, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, дифференцировку Тh0 в Тh1, моноцитов/макрофагов, нейтрофилов и NK-клеток, усиливает экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости МНС I (Major Histocompatibility Complex) и МНС II. В аспекте БА наиболее актуальна способность IFNγ вызывать дифференцировку наивных CD4+ клеток в Тh1 и ингибировать пролиферацию Тh2. IFNγ является отрицательным сигналом для Тh2 и надежным маркером субпопуляции Тh1 [13, 14].

В исследованиях Н.И. Баранова и соавт. (2014) установлена важная роль генетических полиморфизмов IL-4, IL-10 и IL-17 в патогенезе аллергических заболеваний, отмечена ассоциация полиморфизма генов данных цитокинов с количественным отклонением цитокинов и формированием той или иной формы аллергического заболевания [15].

В литературе представлены данные о выявлении функционального полиморфизма генов цитокинов, связанного с заменами единичных нуклеотидов, вызывающих количественные изменения функционирования соответствующих генов, в отличие от мутаций, полностью выключающих функции кодируемых ими белков [16–20]. Обладая значительной вариабельностью, цитокины характеризуются наличием однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с изменением синтеза биохимических продуктов у больных с различными аллергическими заболеваниями [21–23].

Цель исследования: характеристика полиморфизмов генов цитокинов — IL-4 (С-589Т) и IFNγ (874 A/T), а также спонтанной и индуцированной продукции клетками периферической крови цитокинов IL-4, IFNγ у детей с БА.

Материал и методы

Обследованы 60 детей (в возрасте 3–11 лет) с верифицированным диагнозом БА средней степени тяжести в межприступный период, находящихся на диспансерном наблюдении в городском аллерго-респираторном центре, и 100 сопоставимых по полу и возрасту здоровых сверстников, наблюдавшихся в центре здоровья КГБУЗ «ВКДЦ». Верификация БА проводилась в соответствии с рекомендациями международного согласительного документа PRACTALL (The European Pediatric Asthma Group Diagnosis and treatment of asthma in childhood: a PRACTALL consensus report — Диагностика и лечение астмы в детском возрасте: консенсусный доклад PRACTALL. European Academy of Allergy and Clinical Immunology and the American Academy of Allergy — Европейская академия аллергологии и клинической иммунологии) по данным наследственного анамнеза, анамнеза заболевания, аллергологического обследования (скарификационные пробы, определение общего и специфического иммуноглобулина IgE к бытовым, эпидермальным, пыльцевым аллергенам в сыворотке крови). Комплексное клинико-лабораторное обследование и наблюдение проведено на кафедре клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии и в центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России.

Материалом исследования являлась венозная кровь. Геномную ДНК выделяли при помощи коммерческого набора для выделения ДНК High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Швейцария) с дальнейшей оценкой генотипа IL-4 C-590T и генотипа IFNγ 874ТТ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР; использовались наборы «Гено Технология», Россия). Оценку результатов аллель-специфической ПЦР проводили при помощи горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозном геле («Литех», Россия).

Полученную в ходе электрофореза картину анализировали с использованием системы детекции VersaDoc Imaging System («Bio-Rad», США). Для анализа вариантов полиморфизма 874 A/T гена IFNγ использовали метод ПЦР в реальном времени по технологии TaqMan. Продукцию IFNγ и IL-4 клетками цельной крови исследовали с применением тест-системы «ЦИТОКИН-СТИМУЛ–БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием прикладных программ «Статистика-10» (StatSoft, США). При сравнении двух выборочных средних в пределах одной выборки использовали критерий Вилкоксона, при сравнении групп между собой — критерий Манна — Уитни. Показатели представлены в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q25; Q75). Для обработки цифровых данных использовали методы сравнения несвязанных групп по качественным признакам, оценку соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди — Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в двух субпопуляциях использовали критерий хи-квадрат. Cилу ассоциаций оценивали в значениях отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования

Результаты распределения показателей частоты встречаемости генотипов полиморфизма IFNγ (874 A/T) и IL-4 (C-590T) у здоровых детей и детей с БА представлены в таблице 1. Концентрации цитокинов сыворотки крови с различными генотипами IFNγ (874 A/T) и IL-4 (C-590T) в группе здоровых детей и детей с БА указаны в таблице 2.

10-1.png

10-2.png

Сравнительное исследование частот генотипов IFNγ (874 A/T) показало, что генотип IFNγ (874 ТТ) статистически реже встречался у больных БА, чем у здоровых детей (ОШ=0,198; 95% ДИ 0,068–0,580). При анализе спонтанной и индуцированной митогеном продукции IFNγ с генотипом ТТ различия уровней продукции оказались статистически незначимыми. Кроме того, гетерозиготное носительство в группе контроля АТ полиморфизма (874 АТ) гена IFNγ было также достоверно выше, чем в группе детей с БА (ОШ=0,154; 95% ДИ 0,055–0,432). Отмечено достоверное снижение уровня спонтанной продукции при увеличении индуцированной митогеном продукции IFNγ. В исследуемых группах с генотипом IFNγ (874 АА) получено достоверное повышение данного полиморфизма у пациентов с БА по сравнению с контрольной группой (ОШ=0,198; 95% ДИ 0,068–0,580), а также выявлено статистически значимое различие в уровнях спонтанной и индуцированной продукции с четкой тенденцией к снижению уровня IFNγ у больных БА.

Характеристика распределения вариаций генотипов в группе здоровых детей без отягощенной аллергической наследственности в структуре генотипов IL-4 такова: гомозиготный СС встречался статистически чаще у здоровых детей (ОШ=0,082; 95% ДИ 0,024–0,283), оценка спонтанной и индуцированной митогеном продукции IL-4 с генотипом СС не выявила статистически значимого различия в уровнях продукции. При анализе варианта ТС полиморфизма IL-4 (C-590T) установлено наиболее выраженное в наблюдаемых группах повышение частоты встречаемости у детей с БА (ОШ=8,636; 95% ДИ 2,891–25,8); гомозиготный вариант ТТ полиморфизма IL-4 (C-590T) также преобладал у детей с БА (ОШ=12,429; 95% ДИ 1,571–98,353). У детей с БА и генотипами ТС и ТТ выявлено определенное статистически значимое увеличение показателей уровня спонтанной и индуцированной митогеном продукции IL-4.

Заключение

При анализе генетической вариации гена IFNγ протективный эффект выявлен при гаплотипе ТТ и гетерозиготном варианте АТ в отношении риска развития БА. Установлена связь между вариантом генотипа и вариантом синтеза цитокинов.

В результате проведенного исследования установлено значительное преобладание гетерозиготного варианта гена IL-4 в группе здоровых детей и группе детей с БА, гаплотип CC превалирует у здоровых детей. Установленные различия полиморфизма генов цитокинов при БА вносят вклад в изучение молекулярно-генетических основ формирования БА и могут быть использованы для персонификации терапии.


Сведения об авторах:

Просекова Елена Викторовна — д.м.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ORCID iD 0000-0001-6632-9800;

Долгополов Максим Сергеевич — ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ORCID iD 0000-0003-4657-6868;

Сабыныч Виталий Александрович — к.м.н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ORCID iD 0000-0003-3874-6433.

ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России. 690002, Россия,
г. Владивосток, просп. Острякова, д. 2.

Контактная информация: Просекова Елена Викторовна, e-mail: pros.ev@mail.ru. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 21.02.2020.

About the authors:

Elena V. Prosekova — MD, PhD, Professor, Head of 
the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General, and Clinical Immunology, ORCID iD 0000-0001-6632-
9800;

Maksim S. Dolgopolov — MD, Assistant of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General, and Clinical Immunology, ORCID iD 0000-0003-4657-6868;

Vitalii A. Sabynych — MD, PhD, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General, and Clinical Immunology, ORCID iD 0000-0003-3874-6433.

Pacific State Medical University. 2, Ostryakov str., Vladi­vostok, 690002, Russian Federation.

Contact information: Elena V. Prosekova, e-mail: pros.ev@mail.ruFinancial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 21.02.2020.



Литература
1. Сепиашвили Р.И. Физиология иммунной системы. М.: Медицина. Здоровье; 2019.
2. Козлов В.А. Иммунная парадигма и иммуносупрессорная доминанта в патогенезе основных заболеваний современного человека. Бюллетень сибирской медицины. 2019;18(1):7–17. DOI: 10.20538/1682-0363-2019-1-7-17.
3. Геппе Н.А., Малахов А.Б., Колосова Н.Г. Современные подходы к диагностике и лечению бронхиальной астмы у детей (по материалам последних версий отечественных и международных рекомендаций). РМЖ. 2015;22:1307–1309.
4. Лещенко И.В., Эсаулова Н.А. Бронхиальная астма: современные вопросы базисной терапии (в помощь практическому врачу). РМЖ. 2015;18:1074–1079.
5. Lambrecht B.N., Hammad H. The immunology of asthma. Nature Immunology. 2015;16(1):45–56. DOI: 10.1038/ni.3049.
6. Курбачева О.М., Жестков А.В., Нагаткин Д.А. и др. Современный взгляд на иммунопатогенез бронхиальной астмы. Российский аллергологический журнал. 2016;2:10–14.
7. Княжеская Н.П. Диагностика и лечение фенотипа бронхиальной астмы с повышенным метаболизмом лейкотриенов. Врач. 2013;(3):82–86.
8. Akdis C.A. The underlying mechanisms in allergy. EAACI Global Atlas of Allergy. Zurich: European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Switzerland. 2014;39–42.
9. Fitzpatrick A.M., Baena-Cagnani C.E., Bacharier L.B. Severe Asthma in Childhood: Recent Advances in Phenotyping and Pathogenesis. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2012;12(2):193–201. DOI: 10.1097/ACI.0b013e32835090ac.
10. Брагина Е.Ю., Фрейдин М.Б., Бабушкина Н.П. и др. Анализ генов цитокиновой сети в развитии «обратной» коморбидности для бронхиальной астмы и туберкулеза. Медицинская генетика. 2017;16(1):20–24.
11. Willem van de V., Mübeccel A. Mechanisms of immune regulation in allergy. Global Atlas of allergy. 2014; 90–91. DOI: 10.1111/imr.12555.
12. Akdis C.A., Agache I. Global Atlas of Asthma. Zurich: EAACI European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Switzerland; 2013.
13. Poulsen L.K. Cytokines in allergy. EAACI Global Atlas of Allergy. Zurich: European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Switzerland; 2014.
14. Wenzel S. Phenotypes and endotypes: Emerging concepts on asthma heterogeneity. EAACI Global atlas of Asthma. Zurich: European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Switzerland. 2013;16:34–36.
15. Баранова Н.И., Коженкова С.В., Ащина Л.А. Роль цитокинов в патогенезе хронической крапивницы. Цитокины и воспаление. 2014;13(1):11–15.
16. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства интерлейкина-1 человека. Цитокины и воспаление. 2005;4(2):3–12.
17. Смольникова М.В., Фрейдин М.Б., Смирнова С.В. Гены цитокинов как генетические маркеры атопической бронхиальной астмы с контролируемым и неконтролируемым течением. Медицинская иммунология. 2017;19(5):605–614. DOI: 10.15789/1563-0625-2017-5-605-614.
18. Жалсанова И.Ж., Брагина Е.Ю., Фрейдин М.Б. и др. Исследование генетических факторов в развитии дистропных болезней на примере бронхиальной астмы и туберкулеза. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. 2018;27:36–47.
19. Смольникова М.В., Смирнова С.В., Тютина О.С. Полиморфизм генов цитокинов при атопической бронхиальной астме. Сибирское медицинское обозрение. 2013;2:3–8. DOI: 10.20333/25000136-2013-2-3-9.
20. Смольникова М.В., Смирнова С.В., Коноплева О.С. Цитокины и полиморфизм промоторных регионов генов (С-590Т IL-4, С-597А IL10) как маркеры неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей. Сибирский научный медицинский журнал. 2015;35(3):4–8.
21. Костина Е.М., Молотилов Б.А., Левашова О.А., Осипова М.В. Изучение полиморфизма генов цитокинов ИЛ 4, ИЛ 10, ИЛ 17А и ТНФA у больных с инфекционно зависимой бронхиальной астмой. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2013;1:53–58.
22. Zhang S., Li Y., Liu Y. Interleukin-4-589C/T Polymorphism is Associated with Increased Pediatric Asthma Risk: a meta-аnalysis. Inflammation. 2015;38(3):1207–1212. DOI: 10.1007/s10753-014-0086-9.
23. Nie W., Meng L., Wang X., Xiu Q. Interferon-gamma +874A/T polymorphism is associated with asthma risk: a meta-analysis. J Investig Allergol Clin Immunol. 2014;24(5):324–330. PMID: 25345302.



Предыдущая статья
Следующая статья